测序结果深度挖掘：IP-MS+分子对接+Co-IP解析蛋白互作验证新范式

高通量转录组、蛋白质组学等技术是挖掘疾病病理机制、筛选功能靶分子的核心技术，仅开展单一差异分子筛选无法明确基因介导的细胞功能、上下游信号通路、蛋白互作结构及体内生物学效应，不足以支撑深度机制解析与临床转化应用。

针对组学筛选得到的核心差异基因 / 蛋白，构建 “筛选+验证+机制探究” 完整研究范式，由宏观通路网络到微观分子结合作用层层递进，系统化解析靶基因生物学功能与调控轴，可实现高效、精准、闭环式的疾病靶点机制挖掘。

案例一

RIP-seq+IP-MS+分子对接筛选（蛋白-蛋白）+Co-IP

文章简介

题目：TRIM56 Modulates YBX1 Degradation to Ameliorate ZBP1-Mediated Neuronal PANoptosis in Spinal Cord Injury

期刊：Advanced Science（14.1）

发表时间：2024年

摘要：脊髓损伤预后差，泛焦亡是关键致病炎性细胞死亡，机制尚不清晰。蛋白组筛选发现损伤神经元 YBX1 显著上调；RIP-seq 证实 YBX1 稳定 Zbp1 mRNA，上调 ZBP1 并加重泛焦亡。IP-MS 与分子对接筛选到 E3 泛素连接酶 TRIM56，其可结合 YBX1 促进泛素化降解，抑制下游泛焦亡。该研究揭示 TRIM56-YBX1-ZBP1 调控轴，为脊髓损伤治疗提供新靶点。

研究详情

TRIM56 通过泛素化降解 YBX1，抑制 ZBP1 介导神经元泛焦亡，改善脊髓损伤

步骤 1

组织蛋白组 + 公共 GEO 数据库初筛核心靶分子 YBX1

步骤 2

RIP-seq 测序筛选 YBX1 下游靶 RNA Zbp1

步骤 3

IP-MS 互作蛋白组筛选与分子对接技术筛选 YBX1 上游调控分子 TRIM56

采用免疫沉淀 - 质谱联用（IP/MS）与分子对接技术筛选 YBX1 的互作分子，结果发现 E3 泛素连接酶 TRIM56 可与 YBX1 发生强结合；通过免疫共沉淀（Co-IP）验证：Flag-TRIM56 与 Myc-YBX1 在细胞内存在强烈相互作用；反向免疫共沉淀进一步证实 TRIM56 能结合并富集 YBX1。

TRIM56 与 YBX1 存在相互作用

步骤 4

体外细胞分层验证 TRIM56 调控 YBX1 泛素化降解；体内 AAV 基因操纵动物闭环验证完整调控轴

案例二

RNA-seq+IP-MS+分子对接

文章简介

题目：Programmed death-ligand 1 (PD-L1) Modulates Chemokine Production Via the TLR4/TRAF6 Signaling Axis During LPS + IFN-γInduced Endotoxemia-mimicked Sepsis

期刊：Inflammation（5.4）

发表时间：2026

摘要：PD-L1 是经典免疫抑制检查点，已知可结合 T 细胞 PD-1 抑制适应性免疫。但本研究发现巨噬细胞 PD-L1 存在促炎作用。经公共临床数据库与 RNA-seq 分析，脓毒症巨噬细胞内 PD-L1 会上调 CCL8、CXCL9 趋化因子。借助 IP-MS、分子对接等手段证实，PD-L1 依靠 TLR4/TRAF6 通路调控两类趋化因子。该研究揭示巨噬细胞 PD-L1 全新促炎调控功能，为脓毒症免疫紊乱治疗提供新思路。

研究详情

巨噬细胞内源 PD-L1 通过 TLR4/TRAF6 轴调控CCL8、CXCL9 趋化因子分泌，介导脓毒症炎症

步骤 1

公共 GEO 转录组 + 临床样本 qPCR 初筛 PD-L1 与脓毒症炎症关联

步骤 2

细胞 RNA-seq 筛选 PD-L1 调控的靶趋化因子

构建 PD-L1 过表达 / 对照 THP-1 巨噬细胞，LPS+IFN-γ 刺激后转录组测序；差异基因交集联合趋化因子基因集筛选，锁定 PD-L1 特异性上调 CCL8、CXCL9；GSEA 再次证实趋化因子、TLR 通路显著富集，qPCR、ELISA 在细胞层面验证该表达差异。

步骤 3

GSEA 通路筛选，确定 TLR4 为上游关键调控分子

步骤 4

IP-MS 筛选 PD-L1 互作蛋白，锁定 TRAF6

对炎症刺激巨噬细胞开展 PD-L1 免疫沉淀质谱，筛出 TLR 通路适配蛋白 TRAF6；Co-IP 细胞实验验证二者直接物理结合；分子对接预测互作结构，截除结合区突变体丧失调控趋化因子功能。

PD-L1 结合 TLR 下游分子 TRAF6，调控 CCL8、CXCL9 表达

步骤 5

细胞干扰 + 脓毒症动物模型完成因果验证

案例三

RNA-seq+IP-MS+分子对接+Co-IP

文章简介

题目：PD-L1 as a Potential Inducer for NF-κB Pathway Activation in M1-Type Macrophages During Sepsis: An Integrated Analysis Based on GEO Public Database and Multi-Omics Data

期刊：Journal of Inflammation Research（4.6）

发表时间：2026

摘要：M1 巨噬细胞极化依赖 NF-κB 通路，免疫检查点 PD-L1 在该细胞中的作用尚不明确。本研究结合公共 GEO 数据集、细胞 RNA-seq、IP-MS、分子对接与 Co-IP 开展体外实验，并利用 PD-L1 敲除小鼠完成体内验证。结果显示脓毒症患者外周细胞 PD-L1 显著高表达，与 NF-κB 通路活化密切相关；PD-L1 可结合通路相关核因子 KLF6 并激活 NF-κB，且 PD-L1 有潜力作为脓毒症预后标志物。该研究初步揭示 PD-L1 对 M1 巨噬细胞 NF-κB 通路的激活作用。

研究详情

脂多糖联合干扰素 γ（LPS+IFN-γ）刺激的 THP-1 巨噬细胞中，PD-L1 可与 NF-κB 通路关键相关转录因子 KLF6 相结合

步骤 1

公共数据库 + 临床样本，确立 PD-L1 与脓毒症、NF-κB 通路的临床关联

步骤 2

体外巨噬细胞转录组（RNA-seq），验证 PD-L1 激活 NF-κB 通路

步骤 3

IP-MS 蛋白组筛选，锁定 PD-L1 互作靶蛋白 KLF6

步骤 4

分子对接 + Co-IP，验证 PD-L1 与 KLF6 直接物理结合

1. AlphaFold 预测 PD-L1、KLF6 全长蛋白三维结构，GRAMM 软件完成蛋白分子对接，得到稳定复合物模型，预测存在 3 处盐桥、12 个氢键结合位点。

2. 细胞免疫共沉淀（Co-IP）双向验证：LPS+IFN-γ 刺激的 THP-1-M 中，PD-L1 可下拉 KLF6，反向 KLF1 抗体亦可富集 PD-L1，证实二者存在直接蛋白相互作用。

PD-L1可与 NF -κB相关转录因子KLF6互作

步骤 5

体内脓毒症 CLP 动物模型，完整验证 PD-L1 通过 NF-κB 调控炎症轴

单一组学数据难以支撑完整调控网络解析，完整机制研究可通过 “测序初筛 + 互作筛选 + 细胞验证” 全套技术支撑。组学测序、IP-MS、分子对接、Co-IP 等相关实验服务，从高通量候选分子挖掘到蛋白互作实体验证全程配套生信分析，高效搭建完整分子机制研究证据链，节省实验周期，助力高分论文产出。

[1] Lou J, Mao Y, Jiang W, et al. TRIM56 Modulates YBX1 Degradation to Ameliorate ZBP1‑Mediated Neuronal PANoptosis in Spinal Cord Injury[J]. Advanced Science, 2024, 11: 2407132. DOI:10.1002/advs.202407132.

[2] Yuan M, Jin T, Ao L Q, et al. Programmed death‑ligand 1 (PD‑L1) Modulates Chemokine Production Via the TLR4/TRAF6 Signaling Axis During LPS + IFN‑γ‑Induced Endotoxemia‑mimicked Sepsis[J]. *Inflammation*, 2026, 49:40. DOI: 10.1007/s10753‑025‑02394‑2

[3] Yuan M, Jin T, Zhao Q, et al. PD‑L1 as a Potential Inducer for NF‑κB Pathway Activation in M1‑Type Macrophages During Sepsis: An Integrated Analysis Based on GEO Public Database and Multi‑Omics Data[J]. Journal of Inflammation Research, 2026, 19: 578828. DOI: 10.2147/JIR.S578828