3D与4D打印在组织工程中的应用

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第五章基于3D和4D打印的医疗器械和组织工程支架的增材制造（AM）

苏迪普·库马尔·辛哈
印度赖布尔国家理工学院冶金工程系，赖布尔，印度

引言

近十年来，生物医学领域在人体组织再生的各个方面都经历了大规模且持续的增长。这一过程主要涉及细胞生长和器官重建，因此组织再生成为全球科学家和学者高度关注的领域。基于过去五十年在硬组织植入物领域的研究可以了解到，器官移植、替代以及固定是治疗受损或损坏器官患者的切实可行方案。全球范围内，器官移植的等待名单司空见惯。截至2017年6月，美国卫生与公共服务部登记了约12万名患者急需各种挽救生命的器官移植，而仅有约5200名捐献者提供了此类器官[1]。显然，等待移植器官的患者数量不断增加，而在过去几十年中，实际完成的移植手术数量在各个年龄组中却基本保持稳定。

因此，迫切需要探索非常规方法来应对可植入器官短缺的需求[1]。

三维（3D）打印是一种基于增材制造的用于工程部件精确三维构建的技术。它在生物医学工程中被广泛应用。尽管目前存在多种类别的增材制造技术，但在此背景下，通常为简便起见而交替使用3D和4D打印这两个术语。该技术始于20世纪80年代后期的一种基于液体的光固化成型法[2]。3D打印（通俗地称为增材制造或快速原型制造）主要是一种分层沉积和制造技术，材料逐层叠加。

在过去的四十年中，已基于这种加工方法开发出多种3D打印技术。美国材料与试验协会（ISO/ASTM 52900:2015）已将增材制造技术划分为50种不同类型，可进一步归为七个不同类别：（i）粘结剂喷射，（ii）基于多种材料的喷射，（iii）材料挤出，（iv）槽内光聚合，（v）粉末床熔融，（vi）能量沉积，以及（vii）片材层压。然而，另一种分类方法则是根据原材料（或墨水）的沉积工艺对3D打印技术进行总体分类。迄今为止，基于挤出的技术是最广泛使用的3D打印技术。这些技术包括熔融丝线制造（熔融沉积成型（FDM））和直接墨水书写或直接书写（DIW）。在这些传统方法中，三维物体通过逐线方式沉积，然后按逐层序列构建而成。唯一的区别在于，FDM是将固体丝状或细丝材料加热后通过喷嘴熔化挤出，而DIW方法则是挤出一种粘稠或半浆状的墨水基溶液，该溶液可能需要后续处理。基于挤出的技术具有优势，因为它们能够打印多种可打印材料。因此，该技术借助数字三维文件（如基于计算机辅助设计（CAD）的图示或CT（计算机断层扫描）成像），采用实体建模方法，通过对进料材料的精确累积，实现各种定制化或复杂工程部件的快速高效制造。

组织工程（TE）的概念最早由兰格和瓦坎蒂于1993年提出，并发表在《科学》杂志的标志性论文中[3]。他们展示了三维可生物降解支架的主要特性及其应用。三维支架应具有高度多孔的形态，具备良好互连的开孔网络，且必须具有均匀且充足的孔径及其分布，以促进细胞增殖和细胞渗透[4]。在此项突破性发明之后，多种制造技术被用于制备这些多孔支架。然而，传统技术存在重大局限性，因其无法支持或不具备足够的能力来精确控制支架结构、孔径及其网络，最终形成的三维支架与理想结构相比不兼容且不够理想。这正是推动采用3D打印技术来制造具有独特结构的定制化支架的动机，这些支架具有良好控制、均匀分布且具备所需尺寸和形状的孔隙[5–7]。

3D打印的应用范围使科学家和工程师能够轻松地进行期望的修改，而无需额外的设备或制造单元。该技术还具有独特优势，使制造商能够构建设备，以复制患者特定解剖结构（定制设备）或制造具有复杂内部组件的设备。这些潜在能力不仅在医疗器械领域，而且在从食品、日用品到汽车零部件等其他应用中，都引发了巨大兴趣。

另一方面，4D打印是一个更新近才被研究的领域，它以3D打印为基础发展而来，在诸多方面具有广阔的应用前景。麻省理工学院的一组研究人员[8]于2013年首次提出了该技术。现代4D打印设备的发展在很大程度上基于现有的3D打印技术、智能材料的快速增长以及数学建模和后续设计的坚实基础。尽管与3D打印相似，4D打印实际上在时间进程中增加了一个额外的维度革命，即所制造的产品会与温度、湿度和光等环境刺激相互作用。这导致活性材料结构随时间按需求发生变化[9–12]。尽管快速兴起且先进的4D打印技术取得了巨大进步，其在生物工程中的精确应用在很大程度上仍依赖于多功能响应性3D可打印材料的开发、能够沉积多种活性材料的高度复杂的3D打印技术，以及可行的计算设计方法来预测3D打印实体在外加刺激下的性能表现。3D和4D打印作为在众多先进生物医学应用中（如传统生物材料、组织和器官再生、慢性疾病、药物递送应用、硬组织替代植入物、生物医学仪器和假体）的新兴技术，其持续增长与发展激励着科学家和研究人员寻求下一阶段的发明。

示意图0

图1 示意图显示了生物医学工程中用于支架制备的各种材料与增材制造过程之间的关系。

2 组织工程中的支架

组织工程的概念最早由兰格和瓦坎蒂于1993年提出。它被认为是一个跨学科领域，与生物科学、材料科学、工程学和医学等多个学科密切相关[13,14]。组织工程直接关系到可再生生物替代物的发展，以保存或恢复因严重损伤而受损的组织功能或整个器官[15]。上述需求可通过使用干细胞来实现。通常，干细胞是一类特殊类型的细胞，它们不会转化为或改变为宿主以外的其他类型细胞。在生命早期和生长阶段，它们具有显著潜力分化为人体内的多种其他细胞类型。

基于此，制造这些结构的主要技术在于能够安全地分布这些干细胞，并构建一个物理和机械性能上坚固稳定的结构，以支持干细胞的生长和维持。通过有效结合组织工程与再生医学，可以在人体解剖学基础上构建支架结构。所制造的支架可以为因各种原因受损的器官及器官系统提供支持或替代。

组织工程的基本方法可以描述如下：第一步，将供体细胞或捐赠细胞及生长因子接种到三维支架上，该支架提供初始支撑，并为细胞附着、增殖和转化提供所需的框架。整个过程在生物反应器中的体外环境中进行培养，以促进新生健康组织基质的生长。最后阶段，将仿生结构移植到患者体内。支架通常具有可生物降解特性，因为在完成特定功能后，新生成的组织可能阻碍其作用[16,17]。

为了开发用于组织工程的多孔支架，已使用多种类型的生物材料，前提是存在可利用现有生物材料特性进行加工的成熟制造技术。

通常，聚合物生物材料是制备支架的常用选择，因为这些材料能够提供细胞附着所需的结构支持，并最终促进组织发育。在用作支架的聚合物材料中，合成聚合物和天然聚合物因其广泛的来源、多样的性能以及良好的生物相容性而被视为潜在的替代材料。最早用于临床应用的可生物降解支架材料属于天然聚合物，这归因于其与不同类型细胞相互作用的优越能力以及不会引发免疫反应的特点。近年来，合成聚合物逐渐出现，因其成本较低且相较于天然材料具有更优的功能性。然而，它们可能存在毒性或引发免疫反应缺失的问题。合成聚合物主要由有机材料组成。

基于聚（L‐乳酸）(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)或聚乳酸‐共‐乙醇酸(PLGA)来形成基于三维结构的支架材料[18,19]。合成聚合物常与天然聚合物混合，以消除与细胞附着、亲水性和生物可降解性相关的不良影响。此外，通过特定配体（如蛋白质分子）对支架表面进行功能化修饰，通常有助于增强细胞响应。

在过去十年中，由合成和天然生物材料开发出的具有纳米纤维特征、水凝胶和烧结微粒的三维支架已被广泛研究[20,21]。这些高孔隙率三维支架的主要作用是在植入物周围创造一种环境，以修复受损或缺失的组织。在三维支架的各种控制因素中，孔隙率在第二代组织工程中起着关键作用，这同时也意味着需要细胞渗入并生长，以及血管化进入所制备支架内的三维孔隙网络[22]。

如前所述，孔隙率起着决定性作用，因为在没有人工血管供应的情况下，细胞网络依赖于相互连通的通道。这种整体效应是由于氧气和各种营养物质以及代谢废物通过多孔支架扩散而产生的。所有这些因素在营养供应、细胞迁移和向支架增殖方面均起着关键作用。它们还增加了未填充的表面积，有利于细胞与支架之间的连接，并与周围组织进行交互，从而在结构上模拟天然的细胞外基质（ECM）环境。必须认识到，当孔径减小时，支架可用的表面积会增加。暴露的支架表面积增大，因而增强了支架配体与细胞形成强结合并相互作用的趋势。然而，若孔径过小，则细胞在支架结构内的迁移将变得困难。此外，由孔隙率分布及其连通性决定的支架比表面积不能过大，否则会降低其机械强度[23]。

鉴于上述观察结果，支架的微观结构应精确设计，以利于细胞活力并促进组织长入。孔径分布与支架性能之间的这种权衡是组织工程中的关键模型之一，因此在新型生物材料的开发过程中必须予以重视。

理想的三维支架材料应由生物相容的、可生物降解的材料组成，其机械性能必须尽可能接近植入物内宿主组织的机械性能。该支架不应被视为永久性植入物。实际上，它们应能引导宿主细胞形成细胞外基质（ECM），并随着时间推移，支架结构应被新生的细胞外基质所替代。从临床角度来看，还期望支架结构能够方便地制成各种形状和尺寸，以便对患者器官和组织中的特定缺损进行原位治疗。

以下列出了理想的支架材料和结构特性：

细胞和组织相容性以及生物降解性：

副产物在从植入式支架材料中降解后应无毒性。
可以合理利用天然与合成支架的协同效应，以控制降解过程，从而改善支架组织工程中的生物相容性。
支架材料应有助于内置的宿主细胞生成其自身的细胞外基质。

生物活性

下一代支架生物材料应能主动与宿主组织相互作用并连接，以刺激组织再生的体内机制。通过这种方式，材料可实现自愈机制，从而通过再生组织替代支架。
它们应具有骨传导性和骨诱导性。
生化信号和生长调节剂源于兴奋的生物组织，与细胞粘附配体相关，促进细胞附着和分化。

例如，通过共价键合或离子交联来合成水凝胶可以帮助蛋白质包埋，从而通过水凝胶的溶胀释放它们。

2.1 支架结构

含有相互连通的孔隙的支架可为内置血管化提供较大的表面积，促进新组织的形成和生长，以利于细胞迁移，并在植入后实现宿主组织融合。支架生物材料应进行改性，以针对目标组织和细胞调节孔径和分布，同时不显著削弱其机械性能或影响支架的机械稳定性。最后，支架材料必须能够随时间降解，与植入后新形成的组织所产生的新的细胞外基质保持同步。

2.2 机械性能

具有相当的抗压强度、弹性和疲劳强度的支架可为宿主组织提供强度和稳定性。器官和组织在力学‐生物学上模仿支架，因此必须在体内条件下保持其结构完整性。

3 组织工程和支架制备用生物材料

已探索了大量材料用于组织工程中支架的前瞻性制造。通常，它们可分为三个子类：天然聚合物、合成聚合物、生物陶瓷和复合材料。在高分子材料类别中，通过在其分子主链中整合特定的官能团来实际制造材料，以确定其化学、物理和生物特性。

这些不同类别的生物材料各自具有期望的优点和缺点。因此，使用由不同相组成的复合支架是合乎逻辑的，这一理念在该应用领域中正变得越来越流行。

3.1 天然聚合物

关于聚合物生物材料的研究在学术界和工业界已有大约60年的历史。生物材料被用作支架生物材料以合成天然聚合物。典型的天然聚合物基生物材料包括胶原蛋白、多种蛋白聚糖、海藻酸盐基亚结构和壳聚糖。这些物质均已尝试并用于组织工程支架的制备。

胶原蛋白是最丰富且天然存在的聚合物生物材料。其他常被提及并用于此目的的天然聚合物包括多糖类（甲壳素、壳聚糖、透明质酸等）、丝素蛋白、纤维蛋白、海藻酸盐、明胶、纤连蛋白等。这些材料在组织工程中已被证明极为有效，因为它们能够在体内条件下进行重构。天然聚合物生物材料具有巨大潜力，可形成保留宿主组织细胞外基质成分的支架。

尽管天然聚合物因其在软组织工程中的广泛应用而表现出优异的生物活性和生物降解性，但其较差的机械强度限制了其在承重应用中的使用。此外，由于天然聚合物降解速率较快，在需要对受损或愈合组织提供绝对支撑的情况下，其应用也显得不足。考虑到这些因素，在制备长期组织支撑时，必须对这些材料进行交联。交联是指将一个聚合物链连接到另一个聚合物链的过程。尽管交联策略本身具有内在的结构优势，但当支架不易被原代细胞占据时，多种交联元素仍可能通过多种方式改变组织。最后，基于天然聚合物的生物材料还容易引发异种困难，因为大多数此类材料来源于动物成分。

3.2 合成聚合物

合成聚合物顾名思义是在实验室或工业装置中，通过一系列化学反应从低分子量有机化合物制备而成。许多合成聚合物已被尝试用于制造支架，并大致分为两类：可生物降解的和不可生物降解的。

可生物降解聚合物包括聚苯乙烯、聚‐L‐乳酸（PLLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸及其共聚物聚乳酸‐羟基乙酸（PLGA）、聚磷腈、聚酸酐、聚丙烯富马酸酯、聚己内酯、聚氨酯等。广泛使用的不可生物降解聚合物包括聚乙烯醇（PVA）、聚羟乙基甲基丙烯酸酯（pHEMA）、聚(N‐异丙基丙烯酰胺)（PNIPA）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）等。这类聚合物支架替代材料的主要优势在于其可控且优异的理化性质（如孔隙率、可降解性和机械强度），无免疫原性，以及得益于多种人工合成技术而具有的易于加工和来源丰富等特点。

另一方面，由于人工聚合物支架的生物活性较差，可能存在被目标组织排斥的风险。研究发现，在整个降解过程中使用合成聚合物支架时，容易产生酸性副产物，进而导致局部pH值降低。这最终会导致其强度下降，并引起细胞组织坏死。

3.3 生物陶瓷

生物陶瓷是一类特殊的无机非金属陶瓷，可来源于天然或合成。它们主要用于肌肉骨骼结构中因损伤或创伤引起的受损部位的修复与再生，以及牙周异常的治疗。尽管生物陶瓷对软组织再生的作用有限，但这些陶瓷材料/支架已广泛应用于承重骨科领域（如髋臼杯涂层）、骨移植/骨水泥以及牙科[24]。生物陶瓷通常具有高机械刚度（杨氏模量）、耐腐蚀性以及坚硬且耐磨的表面。此外，从骨组织的角度来看，由于生物陶瓷在化学成分和结构上与骨或骨组织的矿物质相相似，因而表现出优异的骨传导性和生物相容性。需要指出的是，成骨细胞与生物陶瓷之间的相互作用对于骨再生至关重要，因为陶瓷材料被证实能够促进成骨细胞分化与增殖[25,26]。

尽管具有这些众多优势，但它们也存在严重的缺点，包括断裂韧性不足（导致脆性）、弹性性能低以及极高的刚度[27]。所有这些因素导致了这些材料在组织工程（TE）中的临床应用受限。磷酸钙生物陶瓷由于其与骨和牙齿的相似性，在组织工程实践中备受关注，这种相似性源于其与这些硬质哺乳动物组织的化学相似性。基于磷酸钙的生物陶瓷表现出优异的生物学性能，包括骨传导性和生物可吸收性。这些材料特性有助于通过类似于骨重塑的过程实现与现有组织的整合。此外，基于磷酸钙的生物陶瓷在一定程度上也成功应用于皮肤和肌肉组织替代。然而，这类特殊的生物陶瓷在强度、断裂韧性及抗疲劳性等机械性能方面表现较差，难以满足生物医学领域承重应用的需求。在磷酸钙基生物陶瓷中，由于其结构与植入物和骨缺损具有相似性，因此在硬组织相关生物医学领域，主要研究集中在羟基磷灰石（HA）、α‐和β‐TCP以及双相磷酸钙（biphasic CaPs）上。

[28]羟基磷灰石（HA）[为六方晶系，化学计量比Ca/P为1.67，化学式为Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂]，具有结晶态结构，在磷酸钙中是一种非常稳定的化合物，当置于pH低于4的溶液中时，其溶解度可忽略不计。2[28]。

与此相反，β‐TCP是一种磷酸钙化合物的高温形态，通过在至少高于800°C的温度下热分解获得。β‐TCP的可生物降解特性常被尝试用于骨替代应用，形式包括颗粒、块体或磷酸钙基骨水泥[29]。研究人员发现，尽管这两种磷酸钙基陶瓷在化学成分上类似，但其生物吸收能力却显著不同。羟基磷灰石表现出缓慢的生物再吸收动力学，因此在植入后主要整合到新生骨组织中。而β‐TCP则会在骨组织中被完全重新吸收[30]。

3.4 金属基支架材料

当人类骨骼受损或需要替代时，多孔金属支架因其优异的物理性能以及支持组织长入的能力而成为常用的材料选择。在众多合金中，钛（Ti）和钽（Ta）基金属及合金已被证明是此类应用的最佳候选材料。医用级钛合金由于其比强度高出不锈钢约50%，在骨组织长入能力方面表现更优。其弹性模量（～105 GPa）与人皮质骨（～7–21GPa）相近。该金属/合金还具有优异的耐腐蚀性[31]。

除了铸造的钛合金外，多孔钛（Ti）支架也被研究作为骨替代材料。这些生物材料组分不可生物降解，且不与生物分子同化。

在钛基合金中，Ti‐6Al‐4V特别广泛用于各种骨科应用，因其具有优异的生物相容性，且机械性能优于传统不锈钢、钴基合金甚至纯钛。

最近，一名被诊断出患有癌症的15岁男孩接受了由德国3D打印技术巨头EOS技术公司制造的完美植入物。整个髋关节置换过程，从最初的计算机辅助设计到最终的优化植入物，仅用了六周时间[32]。示意图1

尽管在这一发展中已记录到多种优势，但基于Ti‐6Al‐4V合金中的钒元素以孤立形式仍具有细胞毒性效应，这促使研究人员开发新型β‐Ti合金，并采用铌、锆和钽等无毒元素[33]。

另一方面，多孔金属支架被认为是用于承重应用中与硬组织工程相结合的植入物的理想材料。

它们优异的抗疲劳性[34]以及良好的抗压强度，被发现对于股骨、椎骨、颅骨以及髋关节和膝关节置换等承重应用极为有效。这些多孔构型还表现出与人骨相似且一致的机械性能。此外，它们有助于改善成骨细胞黏附、增殖和分化[35]。在另一种结构设计方法中，薛等人制备了孔隙率范围为17至58体积%、平均孔径为800μm[35]的钛支架。

另一方面，达斯等人[36]的研究表明，对钛及其合金进行表面改性可增强其骨传导性。通过一种称为阳极氧化的化学方法，已在多孔钛支架上生长出二氧化钛（TiO₂）纳米管。这种改性的整体优势在于提高这些支架在模拟体液（SBF）中形成磷灰石的倾向。

尽管有上述优点，金属支架仍存在以下局限性：（i）材料表面的生物反应较差或生物活性不足；（ii）生物分子无法在金属支架内进行化学整合；（iii）通常情况下，金属支架的生物降解性极低甚至完全无法观察到；（iv）天然或通过腐蚀、磨损缓慢释放有毒金属离子/颗粒的可能性是另一个严重问题；（v）多孔金属支架的结构难以保持/维持。

除了永久性生物植入金属外，可生物降解金属在骨折固定等整个组织再生可能的应用中显示出潜力。目前，基于铁（Fe）、镁（Mg）和锌（Zn）的合金被发现是最适合作为可生物降解金属的材料，尤其适用于骨科和心血管应用[37]，因为它们表现出优异的体内生物相容性、较慢的生物降解速率以及足以在再生期间模拟骨组织的机械性能。原则上，与可生物吸收聚合物（如聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）或聚乳酸‐乙醇酸共聚物（PLGA））相比，可生物吸收金属/合金由于其脆性和强度与植入物相当，因而具有更优的机械性能[37,38]。

3.5 生物复合材料

上述单相支架/生物材料存在多种实际困难，限制了其作为先进生物材料的应用，尤其是在需要部分或完全替代受损或病变器官中的宿主组织时。因此，目前大量研究致力于开发生物复合支架，即在基质相中包含纳米和微米尺度的多种填料或增强材料，作为一种可行且有效的替代方案。例如，在特定情况下，纤维状仿生支架结构在先进的软组织工程领域以及前沿的骨组织工程应用中均受到越来越多的关注。所制备的每种生物复合支架均由至少一种非人体天然组分的部分构成。然而，它们仍面临与生物相容性、生物降解性或两者相关的常见 biomedical 问题。已有多种材料被研究用于制造用于组织工程的三维生物复合支架。

复合支架的主要特性包括缓慢降解、良好的细胞生物相容性以及非细胞毒性、非抗原性、非免疫原性和非致突变性作用。据观察，目前使用的生物材料中约有30%属于复合材料类别[39]。在各种组合中，聚合物与陶瓷混合形成的复合支架是最受欢迎的一类。聚合物支架表现出不足的机械性能，例如拉伸强度、弹性模量和韧性。聚合物支架中另一个关键问题是生物活性较差。通过可控地引入陶瓷材料填料（如羟基磷灰石（HA）或磷酸三钙）可消除这些缺陷。

较软的聚合物材料与更强的仿生陶瓷的协同结合可加速组织再生[40]。在用于涉及骨等硬组织的组织工程中常见的天然聚合物列表中，胶原蛋白是最广泛使用的支架材料之一。由于人骨基质的90%–95%由弹性胶原蛋白纤维组成，因此它是制造复合骨组织支架的天然选择。Villa等人通过简单的共沉淀和冷冻铸造法制造了基于胶原蛋白‐羟基磷灰石的复合支架[41]。该复合支架具有高度渗透性，适合细胞浸润、附着和成骨作用，这归因于其99%相互连通的孔隙网络。有趣的是，研究发现，当将支架植入小鼠颅骨缺损进行为期三周的体内测试时，与纯羟基磷灰石相比，缺损处几乎完全被填充。相反，纯羟基磷灰石支架未显示出任何积极效果，并且在植入四名患有长骨缺损的患病患者体内六年后最终发生降解[42]。

除了胶原蛋白外，一些其他常用的天然聚合物如壳聚糖[43]、甲壳素[44]、海藻酸盐[45]和丝素蛋白[46]已成功与羟基磷灰石结合，用于骨组织工程中的替代材料。然而，使用这些天然聚合物材料所面临的困难是其机械性能较差[47]。因此，研究人员已多次尝试通过将羟基磷灰石与可生物降解合成聚合物结合来避免天然聚合物在机械强度方面的潜在缺陷，例如聚乳酸[48]、聚(ε‐己内酯)(PCL)[49]、聚(乳酸‐共‐乙醇酸)[47]和聚(D,L‐丙交酯)[50]。张等人[51]展示了采用不同HA/PCL重量百分比并引入可控孔隙率所合成的纳米HA/PCL螺旋支架的骨传导特性及细胞成熟行为。他们发现，在多种纳米HA/PCL螺旋支架中，最佳HA/PCL组成比例约为1∶4(加权平均值)，适用于骨组织再生。

Hermenean等人[52]制备了新型三维壳聚糖(CHT)支架，并用氧化石墨烯(GO)进行增强，以研究在临界尺寸小鼠颅骨缺损中骨组织再生的成骨分化。这些复合材料作为植入物展现出良好的前景，与单独使用壳聚糖相比，在壳聚糖/GO替代的缺损中显示出更多的新生骨。在这些复合支架中，壳聚糖与GO结合后，在体外和体内试验中均观察到碱性磷酸酶活性的增加。

4 直接三维打印工艺

3D打印技术通常在大气条件下使用多种形式的材料[53]，例如具有固化能力的流体、柔性丝材、分层或层压的薄片以及细小的粉末颗粒。

一种特定方法利用特定形式的材料来制备支架。然而，如果某种特定材料被制备成适合3D打印的形态，并不能确保该物质可进行3D打印，因为要满足垂直方向上的打印要求，还需在支架材料的层间赋予足够的结合强度。因此，在设计用于3D支架制造的物体时，首要考虑因素是初始阶段所使用的材料类型。

此外，为了扩充可3D打印的生物支架种类，未来应开发新颖且高效的方法，将现有的生物材料类别转化为适合3D打印的进料材料形态。例如，明胶凝胶在温度降低时会固化，但在低温环境下操作不利于细胞的有效生长。这促使人们开发新的方法和机制，以实现明胶的便捷固化，例如采用酶交联[54]，或一种新型杂化方法，可在更低温度下促进水凝胶和细胞的生长[55]。

近20–25年来，快速原型技术不断发展，因此各种不同的3D打印和增材制造技术已被尝试用于医学应用。最常用的3D/4D打印技术包括挤出打印/生物打印、立体光刻（SLA）、粉末沉积打印（FDM）、激光辅助打印（SLS或SLM）以及直接墨水书写或喷墨生物打印（DIW等）。示意图2

图3 三种主要3D/4D打印技术的示意图：（A）立体光刻（SLA），（B）熔融沉积成型（FDM），和（C）选择性激光烧结（SLS）。

此外，表1中提供了关于各项技术的基本特征、相应优缺点及其应用的全面综述。

4.1 立体光刻（SLA）

立体光刻（SLA）3D打印技术基于使用光敏聚合物（也称为光聚合物）作为原料，通过将原料溶液聚合成指定图案来实现成型。紫外灯泡或激光束通过数字微镜精确地投射到该光敏聚合物上，从而实现可控反应。该技术采用逐层工艺，每一层必须完全固化或干燥后，才能沉积与其相邻的下一层，以获得所需的3D打印物体。

在各种增材制造过程中，立体光刻是应用于骨组织工程的最古老技术之一。这种复杂的方法能够以非常高的精度制造支架，用于构建从微米到纳米尺度的复杂结构。其他技术（如基于挤出的工艺）则涉及更高数量级的微米尺度[68]。该技术具有独特优势，可制造具有内部复杂性和极高分辨率（1.2微米）的复杂支架结构[68]。此外，高打印质量、及时性以及细胞增殖和分化能力是使SLA技术成为制造骨组织工程结构的一种广受认可的工艺的额外优势。

当使用基于立体光刻（SLA）的3D打印技术构建三维物体时，必须采取额外措施，以根据特定宿主器官的要求增强最终可替换结构的机械性能。因此，必须精确地进行抛光，并消除作为附着残留的不良支架结构。

该方法通过控制可被紫外光或其他形式的光照射的预测量溶液，逐层构建具有梯度机械性能和生物相容性特征的多层三维异质结构，从而能够在垂直和水平方向上延伸构造三维支架。[69,70].

然而，在应用该技术后，已发现若干缺陷。其中一个主要缺点源于所用树脂具有致癌效应，可能危及生命。另一个常见问题是树脂具有光敏性，因此会影响所制备支架结构的长期稳定性。3D打印物体极慢的生产速率（1–3 cm/h⁻¹）是立体光刻（SLA）技术面临的又一挑战[73]。聚合过程常用的紫外光源也带来另一重威胁，因为有报告显示该光源会损伤DNA细胞，可能引发皮肤癌[74,75]。为解决此问题，可见光已被作为替代光源应用于基于立体光刻的生物打印系统，并在此领域获得广泛认可。最近，不列颠哥伦比亚大学的一组研究人员成功开发出一种定制生物打印单元，该单元包含一个光束投影仪，并以PEGDA、明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）和曙红Y组成的光引发剂作为注入的生物墨水[76]。聚(D,L‐乳酸)基树脂或聚(D,L‐乳酸‐co‐3‐己内酯)基树脂被用作原材料来制造多孔支架。通过调控孔隙结构和聚合物组成，可优化支架物体的机械性能和稳定性。Elomaa等人借助高凝胶含量的网络成功制备了可光交联的PCL基树脂[77]。类似地，研究人员也利用树脂、抑制剂和染料开发出了多孔支架。此类所制备的支架能很好地贴合目标物体，并展示了该树脂在构建组织工程支架方面的可行性。

近年来，越来越多的新型且具有前景的可生物降解树脂被广泛使用。在这方面，已开发出多种材料作为立体光刻（SLA）工艺应用中的有前途的替代品，其中包括聚己内酯[77]、聚(D,L‐丙交酯)(PDLLA)[78,79]，和聚丙烯富马酸酯‐富马酸二乙酯(PPF‐DEF)[80]。在另一项研究中，Winder等人[81]利用基于SLA的树脂直接合成了自调节颅骨钛(Ti)假体，从而使该工艺适用于工业规模生产。总体而言，立体光刻（SLA）技术被用于与血管、软骨、肌细胞‐神经元共培养等相关的组织工程应用。

从未来发展角度来看，开发各种新型的生物相容和可生物降解的光固化聚合物对于成功实施这一技术至关重要。同时，为了涵盖聚合物材料列表，近期迫切需要设计和开发基于可见光的STA系统。

4.2 基于微挤出的3D生物打印

基于挤出的技术由于其简单性、多样性和可预测性，已被广泛尝试作为支架制备的替代方法。这种基于挤出的方法利用机械（活塞或螺杆）或气动力，通过连接装有墨水的墨盒的喷嘴或针头输送生物墨水。随后的微图案化过程遵循计算机生成设计。在此过程中，有机生物材料的丝材从μ‐挤出顶部在二维平面上逐层沉积，而μ‐挤出头则沿z轴向下移动。在μ‐挤出打印机中，可将多个墨盒连接到仪器上，用于打印异质结构。在此过程中，细胞与生物墨水混合。生物墨水是用于包裹细胞的材料，可为细胞提供类似细胞外基质（ECM）的环境，并保护细胞免受打印过程中所经历的扰动。喷墨打印广泛用于含细胞组装体的3D打印，因为它相比μ‐挤出打印能够提供优良的细胞活力。然而，在大多数聚合物体系中，粘稠或黏性生物墨水的打印相当困难。这促使研究人员采用μ‐挤出打印来打印胶状生物墨水。通过μ‐挤出打印常用的生物墨水所表现出的黏度范围在30–6×10⁷ mPas[82]之间。为了满足人体各种内部器官结构复杂性及高分辨率的要求，生物墨水应具备剪切变稀能力，以便通过针头实现微挤出。此外，还应具备快速凝胶特性，以实现分层沉积并保持打印轮廓[83,84]。

另一方面，生物墨水基材料凝胶性能和黏弹性倾向的改善可能会导致剪切应力增加。这将严重影响典型的μ‐挤出式打印过程中的细胞。所有这些因素都会导致靶向细胞过早死亡，并损害μ‐挤出式细胞打印实践[82]。考虑到这些因素，必须认识到，在采用μ‐挤出式打印工艺制备过程中，合适的生物墨水黏弹性范围至今仍是需要评估的关键因素。在这方面，Markstedt及其同事研究了纳米纤维素‐海藻酸基复合生物墨水与人软骨细胞结合时的流变功能和打印能力。他们发现这些细胞的存活率为～73%[85]。在另一次尝试中，Kesti等人研究了一种由聚(N‐异丙基丙烯酰胺)、透明质酸和甲基丙烯酰化透明质酸组成的组合，作为一种前景良好的生物墨水材料，该材料的选择完全基于其流变性能、溶胀性能、可打印性以及先前的生物相容性结果[86]。另一组研究人员[87]展示了基于多肽‐DNA水凝胶的多层三维μ‐挤出式打印技术，用于研究其愈合特性及作为新一代生物墨水替代材料所具备的优异机械强度。

基于μ挤出的生物打印工具已成功用于制造骨软骨再生所需的异质支架。最近，埃斯法哈尼等人应用这种打印方法制备了具有足够强度和韧性的玻璃陶瓷支架，可用于在静态载荷下修复骨缺损。六边形互连多孔结构能够在打印层包围的接触区域附近或内部形成广泛的表面，并在与其他常见图案（如矩形、锯齿形或拱形）对比时展现出更优的载荷传递潜力。此外，该先进技术设计在体内条件下表现出优异的抗疲劳性、失效可靠性和抗弯强度。这种用于
硬组织的支架制备方法可能为骨科中与承重应用相关的骨缺损处理以及牙科和颌面修复提供新的机会。在[88]挤出式生物打印中，生物墨水既包括牛顿流体也包括非牛顿流体，并已被广泛改性以提高可打印粘度。对于非牛顿流体，生物墨水的可打印粘度可通过整个打印过程中应变率的变化进行优化，这也取决于其浓度和分子量。除了喷嘴孔的形状外，其尺寸以及活性温度（对于温度敏感型生物墨水而言）也会影响整个打印过程中的应变率。生物墨水通常受剪切稀化效应控制，随着应变率的增加，黏度降低，这不仅有助于保护细胞，还能提高打印分辨率。剪切稀化过程限制了有机分子链因相互滑动而产生的缠结，从而进一步帮助粘性生物墨水顺利通过喷嘴开口实现挤出。基于这一现象，全球研究人员已尝试改进μ挤出式生物打印所用粘性生物墨水的剪切稀化特性μ。与喷墨生物打印相比，[89]挤出式生物打印可实现更密集的细胞生长，但牺牲了速度和分辨率μ。此外，借助这种相对低成本的生物打印设备，可以打印多种生物材料，包括组织球体、组织条带、细胞团块、去细胞基质部分以及含细胞水凝胶。作为一种简单而实用的替代方案，许多研究人员已对现有的商用3D打印设备进行改造以打印支架结构，或自行内部制造打印设备，从而降低成本[90]–[91]。

4.3 基于喷墨的3D打印

喷墨打印是当今使用极为广泛的生物打印技术。通过喷墨进行的3D打印有时被视为立体光刻的一种替代工艺[94]。然而，与基于挤出的工艺相比，喷墨方法在3D生物打印中的应用受到一定限制。其主要原因是打印头的移动以提供打印溶液的连续流动，这限制了其在生物打印中的相关性。生物打印是一种增材制造过程。此外，它是一种先进的技术，通过在三维空间中排列细胞成分来仿生人体组织功能，从而实现功能性组织的三维结构生物制造。该过程可通过在依赖于计算机辅助设计模型的三维设计支架上包埋细胞，高效地制造用于组织再生的生物材料支架，并且具有使用生物墨水封装细胞来构建三维结构的优势[95]。三维喷墨打印以其能够构建适用于生物应用的各种临床尺寸的复杂支架而著称。此外，所开发的产品便于携带。聚(ε‐己内酯)PCL、聚乙醇酸、聚乳酸等合成聚合物主要被用作生物墨水[96]。瓦尔恰克等人首次设计并制造了用于毛细管凝胶电泳的微流控通道芯片。构建该生物芯片所需时间约为3小时，相较于传统工艺，这体现了喷墨打印过程的优势[97]。克里韦茨等人采用光敏聚合物制造了三维打印原型封装，并结合银纳米颗粒墨水实现射频识别，以增强无线雷达信号[98]。基沃布拉等人使用无溶剂的三维热喷墨打印技术，利用天然衍生物制造药物释放载体。所制造药物的结构设计为具有可控细胞尺寸的蜂窝结构。作者旨在通过三维喷墨打印技术，使用蜂蜡制成蜂窝结构形状的药物释放片剂，最终可作为固体制剂在临床上使用[99]。张等人应用喷墨(ij)三维打印方法开发了具有微观/宏观尺度可控孔隙率的基于羟基磷灰石的支架。此外，还展示了不同直径的羟基磷灰石纳米粉末所制备的三维打印生物陶瓷支架在抗压强度方面的机械性能[100]。菲利皮等人利用喷墨打印技术实现了图案化生长因子的制备。在他们的研究中，作者使用成体干细胞通过干细胞分化来调控细胞命运。该生物学方法通过固定生长因子应用于成骨性BMP‐2，在再生医学中具有最终的应用潜力[101]。高等人开发了一种生物打印支架，并表现出优异的生物相容性。生物墨水由聚乙二醇和磷酸盐缓冲液组成，随后与人骨髓间充质干细胞（hMSCs）混合。三维喷墨打印聚合物支架显示出良好的细胞活力和优越的机械性能。此外，由于工艺复杂性降低，建造时间也得以缩短。

休斯等人开发了包含纤维蛋白原和海藻酸盐的生物墨水，通过喷墨三维打印机制造自支撑微血管。采用海藻酸盐基溶液对这些微血管进行生物打印。利用海藻酸盐模板法，可通过三维喷墨打印方法将细胞加载至纤维蛋白支架内部[102]。根据崔等人[103]的研究，喷墨打印过程中可能存在损伤细胞的风险。作者还研究了3D打印的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，并评估了细胞活力。此外，作者检查了受损细胞膜的可能数量，发现这种热喷墨打印方法是一种有效且可靠的打印哺乳动物细胞的方式[103]。Owczarczak等人[104]使用热喷墨打印机将g‐肌动蛋白单体注入3T3成纤维细胞。他们所采用的技术不会对细胞造成伤害，并能将分子与细胞一同注入。此外，该方法表现出优异的细胞活力。Inzana等人借助喷墨3D打印方法优化了机械性能以及生物相容性。通过将磷酸粘结剂溶液与胶原蛋白混合，优化了胶原‐磷酸钙的制备。这增强了细胞相容性，有利于更好的骨再生[105]。Xu等人结合纤维蛋白和NT2细胞，采用逐层构建法制造三维细胞结构，形成具有广泛组织工程应用功能的神经细胞片[106]。

4.4 熔融沉积成型（FDM）

FDM是一种应用最广泛的基于丝材挤出的增材制造过程，用于开发适用于生物工程应用的低成本复杂三维物体。该技术也被称为熔丝制造（FFF）过程，最早于1991[107]实现商业应用。在此技术中，热塑性丝材或小珠状聚合物以可控速率从可移动平台上的小喷嘴中挤出。喷嘴处设有附加加热器，用于首先熔化或软化丝材。在喷嘴末端还配备风扇作为附加装置，以控制所制备的固体三维物体在逐层方式下的固化及后续沉积速率。工艺参数在成功制备具有预定孔径、多孔网络形态和内部连接的三维结构中起着关键作用，这些参数包括扫描线直径、间隙宽度、扫描线角度等。[108]。所有这些因素使得FDM相较于其他传统技术（如光刻技术和微加工）而言，成为一种更为简单的制造三维复杂结构的方法，而后者的工艺方法要复杂得多。

然而，FDM存在一些关键问题，例如与其他常用的3D打印技术相比，操作时间较长且分辨率较低。此外，在制备三维支架时，热塑性材料需要在120°C至300°C的温度范围内进行较高沉积温度的操作，这不利于在细丝中植入细胞或药物。另外，这种用于支架制备的3D打印方法仅允许有限种类的热塑性聚合物用于商业应用，例如聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）、聚（乳酸‐共‐乙醇酸）（PLGA）、丙烯腈‐丁二烯‐苯乙烯共聚物（ABS）和聚乳酸（PLA）。其中一些聚合物物质经常在FDM过程中与生物材料结合使用，以生产具有低熔点的组织工程支架。

在这些材料中，PCL是最佳选择材料，已广泛应用于牙科应用和伤口修复，因为它具有高可打印性以及与可替换组织良好的生物相容性。在基于骨再生应用的支架制备中，FDM已被证明非常有效，因其具备优良的机械强度和理化性质，与人体骨结构高度匹配[109–111]。天然或合成生物聚合物的机械和生物医学性能可通过掺杂生物相容性增强单元（如HA和β‐磷酸三钙（β‐TCP）[112]或简单涂层[113,114]进行改性。Korpela等人通过该方法开发了基于PCL/生物活性玻璃（BG）的复合支架。他们展示了在压缩模量和所需生物相容性方面均具有优异性能[115]。

Oladapo等人[116]开发了一种新型混合支架结构，该结构以聚乳酸（PLA）为基质，并以不同比例添加碳水化合物颗粒（cHA）（PLA:cHA¼ 10/0, 95/5, 90/10和80/20），用于骨组织替代。其中，80:20比例的混合复合材料比其他比例具有更优的性能。通过计算机辅助设计以及后续的逐层打印和固化所制备的3D打印复杂结构支架的孔径变化和孔隙率分布网络如图4所示。

示意图3

图4 通过FDM技术制备的基于聚乳酸/碳水化合物型羟基磷灰石的混合支架促进骨形成的示意图，（A）通过3D打印制备的双层支架的光学图像，（B）显示连续层中四重对称性的三维结构，（C）3D打印结构的径向结构，不同层以同心图案填充，（D）3D打印支架的扫描电镜图像，纤维间距一致为1mm[116]。版权所有2019年。经Elsevier许可转载。 https://doi.org/10.1016/j.compositesb.2018.09.065。

4.5 选择性激光烧结（SLS）

SLS是一种由卡尔·德卡德在20世纪80年代于德克萨斯大学开发并于1989年获得专利的广泛应用的激光辅助增材制造（LAAM）技术。选择性激光烧结（SLS）采用高功率CO₂激光，熔化聚合物或陶瓷粉末的薄层，以根据3D CAD模型、3D数字化系统获取的数据、CT扫描和MRI扫描记录来构建零件的结构和复制品。在SLS过程中，沉积材料的预期层通过化学键相互结合，以形成由基于CAD的3D模型所描绘的特定形状。在SLS中，粉末沉积系统通常包含一组滚轮或刮刀，使设备能够逐层沉积连续的粉末，厚度范围为20–150μm，从而形成固体三维物体。SLS过程中的整个制造操作通常在惰性气氛（例如Ar、N₂）下进行，以生产无污染的三维物体，并避免原料颗粒粉末在过程中发生不必要的氧化。SLS常常存在所制造部件表面轮廓质量较低以及各个维度（X、Y或Z）出现显著波动的问题。因此，作为次要选择，需要进行昂贵的后处理表面处理，如机械加工、热处理、抛光等。[117]与任何其他增材制造工艺一样，复合支架的最终相聚集状态和多孔微观结构可通过控制关键工艺参数来确定，包括激光功率、平台温度、激光扫描速度等。[118]此外，粉末颗粒的尺寸和形状被认为是SLS过程中的决定性因素。[119]这些参数对粉末颗粒的致密化行为和流动性表现出显著影响。粉末颗粒的流动性能是一个重要方面，因为这些粉末必须在高温下均匀分散，且厚度为～100μm。所有这些因素表明，SLS中使用的粉末颗粒应具备特定的粒度分布和优异的球形度。

在SLS中，为了制造具有层间成分差异的三维结构，必须清理由粉末颗粒组成的连续基底，并添加新的生物材料物质。这种沉积方法速度慢且耗时，同时还可能污染新表面层。粉末颗粒的非均质混合给所制备的支架带来了相关问题。一些研究人员[120]提出了一种替代方法，通过预设粉末层并逐次物理添加每一沉积层。该研究成功合成了具有不同化学计量HAp层的PCL以及PCL/羟基磷灰石基组合支架，以模拟骨软骨单元的梯度结构。

SLS工艺已成功用于制造各种形式的生物材料支架，包括生物聚合物、生物陶瓷、生物复合材料甚至金属部件，可用于潜在的组织再生应用。已经确定生物相容性、生物活性和生物降解性是组织工程支架结构的发展。然而，具备上述特性的可用材料在此用途上仍十分有限。尽管如此，针对生物医学应用的组织工程3D支架，研究人员已开展了诸多努力。一些已成功应用于选择性激光烧结工艺以制造骨及其他硬组织工程支架复杂结构的例子包括聚ε)己内酯(PCL)[121,122]、聚‐L‐交酯(PLLA)[123]、聚‐D‐交酯(PDLA)[124]、聚羟基丁酸酯(PHB)[125]，和聚(3‐羟基丁酸‐共‐3‐羟基戊酸酯)(PHBV)[123]。另一方面，非生物可降解聚合物如聚醚醚酮(PEEK)[126]和超高分子量聚乙烯(UHMWPE)[127]已被有效转化为烧结3D支架；这些材料最近已得到研究。

同样，为了在混合组织工程复合材料中获得可生物降解聚合物和生物活性陶瓷（如羟基磷灰石（HA）和β‐磷酸三钙（β‐TCP））的双重优势，已通过SLS技术制备了HA/PCL、HA/聚(L‐乳酸‐co‐乙醇酸)（PLGA）以及β‐TCP/PLGA[128,129]。研究人员已将通过选择性激光烧结工艺开发的纳米HA/PCL和基于PCL的复合支架植入兔股骨缺损中。他们的研究表明，这些支架具有优异的生物相容性，并对骨缺损修复表现出积极效果[122]。在最近的一项研究中，研究人员开发了一种具有更优性能的SLS技术改进版本，称为表面选择性激光烧结(SSLS)，以抵抗生物聚合物降解，并促进细胞实体吸收和生物活性因子[130,131]。

5 间接3D打印工艺

与直接增材制造技术相比，牺牲模具的3D打印和间接3D打印也是多功能的技术，目前在组织工程支架制备中正逐渐被广泛接受。这些3D支架结构设计与制备方法在实现具有均匀连通性、理想孔径以及多面化内外结构的支架方面展现出巨大前景，且所使用的计算机辅助设计/计算机辅助制造模型与直接方法类似但更为复杂。在这种支架制备方法中，支架制备的灵活性得到增强，可适用于从聚合物到陶瓷的多种生物材料。原则上，这种间接3D制造技术使用一个牺牲模具。该模具是一种预设计的假结构，具有目标支架结构的负向框架。

随后，将制备好的模具用于最终生物材料支架的固化。这种间接3D打印方法适用于由各种生物材料制造聚合物和陶瓷支架。陶瓷支架包括氧化铝[132]、羟基磷灰石等，而聚合物支架则通过聚(ε‐己内酯)(PCL)、聚(乳酸‐co‐羟基乙酸)(PLGA)、聚(L‐乳酸)、胶原蛋白以及壳聚糖‐海藻酸盐[133–136]来制备。在制造聚合物支架时，采用间接3D打印这些技术在很大程度上采用基于溶剂的设计并使用临时模具。注入模腔的材料以有机溶剂的形式进行制备。这会导致支架制备时间增加，因为需要更多时间将所提出的材料与溶剂混合，并通过溶质‐溶剂反应或在环境中热蒸发使其在模具内固化。从这一角度来看，必须指出有机溶剂的性质和溶液组成可能会影响支架内部结构，例如相互连通的孔隙网络的尺寸和形貌。因此，由于支架制备过程中产生的这类三维结构/构型异常，可能导致不良的力学性能，并在植入物植入患者体内后对组织工程结构的力化性能产生不利影响。

间接打印方法通过创建能够精确替代受损宿主器官的定制支架展现出独特优势。在一项研究中[137]，科学家打印出与人下颌骨髁突完全匹配的定制支架。通过使用间接3D打印技术，他们制备了由PCL和壳聚糖适当组合而成的仿生支架。将PCL溶解于氯仿中，随后倒入由3D打印制备的明胶模具中。

干燥后，将支架置于50°C的dH₂O中6小时以去除三维打印的明胶模具。PCL支架制备完成后，对其涂覆一层薄的羟基磷灰石层，以促进骨髓基质细胞（BMSCs）的细胞生长。因此，与未涂层复合支架相比，所制备的PCL羟基磷灰石涂层支架表现出更优异的BMSCs增殖特性。

胶原蛋白或海藻酸盐等天然聚合物也已被用于间接3D打印方法中的支架制造。这些天然来源的优异支架的主要优势在于其能够在体外特异性地促进人间充质干细胞（hMSCs）生长一段时间（长达4周），同时对其他生长的细胞具有显著较低甚至无细胞毒性[138]。

6 四维打印在生物医学应用中的应用

增材制造技术的快速发展以及在构建复杂的生物相容性结构方面3D生物打印的进步，激励了全球的科学家和工程师致力于开发类似的但更高效的第四维度技术。4D打印技术的革新在很大程度上受到可3D打印“智能”材料发展的启发。4D打印物体的概念最早于2013年由麻省理工学院自组装实验室成功展示。该实验室的联合主任斯凯拉·蒂比特也被视为4D打印技术先驱[139]。在他的2013年TED演讲（TED代表技术、娱乐与设计）中，蒂比特解释了材料在结构设计中暴露于编程刺激因素（包括渗透压、热效应、电流、紫外光或其他能源）时发生的自驱动形状转变现象[139–142]。此前发现，3D生物打印的一个主要缺陷是其主要基于待3D转换对象的初始条件，假设该对象为静止且惰性的。相比之下，4D生物打印应运而生，它将“时间”因素与3D生物打印结合，作为第四或最终维度。然而，在这种分类中，时间并不表示完成任务的实际时间，而是决定了3D打印的生物相容性支架或活细胞组装在打印后能够随时间发生“自我转变”。

示意图4

图5 来自Scopus数据库关于4D打印或3D打印+生物医学+ FDM/SLS/喷墨打印等主题的出版物在2012年至2019年1月期间的统计记录：（A）出版物数量，（B）不同国家/地区的出版物数量，（C）各种3D打印技术的总出版物列表。

提升最终组织产品的功能和/或性能驱动能力[143,144]一直是组织工程研究中的瓶颈。

通过实施 specially designed shape memory scaffolds 的3D打印，再生医学领域已探索到巨大机遇，这得益于3D打印与源于时间依赖性因素的形状记忆效应之间的有利结合。因此值得一提的是，机械刺激（例如应变模式、灌注）对特定细胞的重构具有显著影响[145,146]。这些细胞通常响应生物刺激，并最终控制细胞活动和再生组织的效率[147,148]。然而，该应用中广泛使用的生化装置结构复杂且成本高昂，同时其应用范围对此目的而言尚不充分[149]。此外，一些材料在受到机械刺激时可表现出自演化结构，执行几何折叠、卷曲、膨胀及其他预设的形状变化，例如形状记忆聚合物（SMPs），这些材料正被考虑用于此目的[150]。已有少数研究利用形状记忆聚合物，展示了单次机械刺激对接触二维片材的细胞所产生的影响[150,151]。

近年来，全球在4D打印领域取得了巨大发展。值得一提的是，开发各种柔性活性可3D打印生物材料（SAMs）、实现多种活性材料快速制造的先进3D打印技术，以及先进的计算方法，将合理的材料模型转化为对未来扩展具有预见性的3D打印物体，对于设计新型biomedical devices和仿生结构而言至关重要。如前所述，4D打印在3D打印的基础上引入了时间维度，因而相比3D打印具有一些额外优势。它能够制造智能仪器，有助于改变生物仿生材料的智能打印结构的形态和功能。其次，该方法有助于打印薄壁结构或晶格结构，从而有望减少整体打印时间和材料消耗。最近的一项研究证实，自折叠可加快3D物体的快速原型制造，可能使打印时间和材料消耗减少60%–87%[152,153]。除了这些显著优势外，还可巧妙利用由多种刺激引发的形状变化现象，以减少占用空间和运输需求。例如，通过4D打印可将形状记忆聚合物转化为平面结构，便于进行简单的后处理操作、移动以及存储用途。就前瞻性材料而言，4D打印技术使用多种材料，旨在开发用于航空航天、生物医学和biomedicine等领域功能性应用的智能设备、超材料和折纸结构等设备/物体[154,155]。这些应用范围涵盖从微观到宏观尺度。研究发现，与智能金属和陶瓷相比，智能聚合物材料在受到多种刺激时能迅速响应，并表现出显著的可变形性[156]。因此，迄今为止，4D打印主要集中在智能活性聚合物基仿生材料上。以下两类材料作为4D打印的智能活性材料（SAMs）被广泛研究：形状记忆聚合物（SMPs）和水凝胶。

在接下来的部分中，将详细讨论应用于4D打印技术的这两类材料。

6.1 柔性活性形状记忆聚合物

形状记忆聚合物（SMPs）是一类新兴的智能材料，在过去几十年中取得了重大进展。这类特殊的智能材料具有一种独特的能力：在受到适当刺激（主要是热源，尽管化学或电磁类型也有影响）时，能够恢复到3D打印形成的稳定的“记忆”结构。这种形状记忆现象在我们的日常生活中也有所体现。例如，热缩管、先进医疗部件以及航天器中的自展开部件，都是该技术潜在的应用领域。研究发现，这些特殊聚合物中的形状记忆效应并非内在固有，而是与聚合物材料特有的形状记忆性能以及用于编程控制变形的数学模型共同作用的结果。

最初，热响应形状记忆聚合物被允许转变为临时形状，随后置于其转变温度（Ttrans）以上。一旦达到该温度，便产生形状记忆效应，从而恢复出稳定的记忆结构[157]。在生物医学工程中，这些材料在多种应用方面展现出巨大潜力，例如微创植入物（如支架）、自打结缝合线、正畸以及药物递送装置[158–160]。

与金属/合金基或陶瓷基形状记忆材料相比，聚合物基形状记忆材料具有诸多优势，超越了上述两种材料。这些优势包括良好的形状恢复性（可实现400%应变恢复）、低密度、加工灵活性、性能可控（如Tg、刚度、生物降解性和功能梯度能力）、可控制和程序化变形，以及成本效益。

上述典型SMP的特性如下：与传统材料相比，SMPs具有以下优势：具有优异的恢复应变。密度较低。成本效益高。然而，这些材料也存在以下缺点：与其他类别的材料（金属、陶瓷）相比，弹性模量较低。强度较低。

形状记忆聚合物在生物材料和生物启发领域具有广泛的意义[161,162]。聚氨酯基形状记忆聚合物具有优异的生物相容性，因此在植入人体后可用于多种临床组件[163,164]。Wache等人[165]最近完成了一项关于药物递送系统中聚合物血管支架可持续性的形状记忆聚合物可行性研究。在药物递送系统中使用形状记忆聚合物支架后，再狭窄和血栓形成方面均显示出显著改善。同样，已利用紫外LED数字光处理（DLP）打印机制造出基于聚己内酯二甲基丙烯酸酯的形状记忆气管支架[166]。本研究中使用的紫外LED光源波长为405纳米。立体光刻技术利用激光源来制造分层物体。通过高分辨率（μ微米级）投影微立体光刻（PμSL）技术合成了多种可光固化甲基丙烯酸酯基共聚物网络并进行打印[167]。一类特殊的形状记忆聚合物属于可生物降解聚合物，可通过若干单体合成，在该领域展现出巨大前景[168,169]。一个典型例子是基于聚己内酯（PCL）的可生物降解聚合物，其在医学应用方面具有广阔前景[170]。

6.2 基于水凝胶的4D打印

基于水凝胶的4D打印技术主要依赖于长链聚合物交联网络的集成，当水或其他溶剂扩散进入其中时，该网络会膨胀为更大的体积。将这些3D打印结构浸入溶剂后，水凝胶结构首先发生膨胀，从而在两种不同材料之间产生应变失配，进而引发整体形状变化[171–173]。尽管水凝胶较易使用，但其过于柔软，难以转化为组织工程基质所需的刚性构型。此外，快速降解以及打印结构的整体完整性也是这类材料存在的其他缺点。通常，由于这些材料在经历环境变化时表现出优异韧性和体积可变性，因此被用于4D打印。基于天然聚合物的水凝胶典型例子包括葡聚糖、壳聚糖和胶原蛋白，而基于合成聚合物的例子则包括聚（乙烯醇）、聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA；亲水性）和聚丙二醇二甲基丙烯酸酯（PPGDMA）等。基于水凝胶的材料在4D打印中的首次应用已通过Stratasys多材料喷墨3D打印成功实现[174]。在这项最初的尝试中，研究人员实际展示了在流体环境中，一条直链可转变为“MIT”字母图案。通过对基于水凝胶/弹性体的智能铰链进行精确打印，实现了对该自组装过程的空间分布和时间排列的精准控制。随后，Bakarich及其同事制造出一种基于水凝胶的智能温敏阀。为了获得驱动温度范围在20°C至60°C的智能阀门，采用了海藻酸盐/聚(N‐异丙基丙烯酰胺)（PNIPAAm）墨水被合成。这些特殊的智能阀门在温度变化时发生堵塞，从而降低流速，并在60°C时长度缩短了41%至49%。这是因为智能阀门的相变温度处于32–35°C范围内[175]。池上等人[176]将人骨髓间充质干细胞（hMSCs）接种到具有图案化框架的3D生物打印组织组装上。这使得组织组装的转化时间从两天延长至两周，原因是hMSCs引起的基质沉积和环境重构。hMSCs基质沉积现象的最终结果是形成一种坚固的网状结构，易于操作。

总体而言，负载生物活性多元材料（如药物和抗体）的水凝胶作为一项有前景的研究领域已展现出巨大潜力，同时也为人工植入物[177,178]提供了广阔机遇。另一方面，自愈合水凝胶能够内在且持续地修复受损组织，并恢复器官的正常功能。这些特性与其它类似的四维打印技术相结合，极大地推动了自愈合水凝胶在组织与器官再生应用中的研究。

7 影响4D打印的因素

用于生物医学应用的智能材料基于其非常规活性，以模拟需要治疗的特定组织或器官。这些材料能够改变其对环境和自然刺激的生物及机械化学响应性，例如温度、应力、湿度、离子强度、pH值以及电场或磁场。本质上，这些材料旨在以预设的方式发生变化，从而刺激细胞及其附着、增殖和分化。在下一节中，我们将讨论两种外部刺激因素的影响，这些因素决定了四维打印结构中所用智能材料的种类及其性能。

7.1 温度的影响

激活四维打印结构最常见的外部刺激是温度[178,179]。热响应材料，包括形状记忆热塑性塑料和形状记忆热固性塑料，在改变温度时可以折叠、收缩或膨胀。其他几类聚合物表现出相变温度，例如热固性树脂中的玻璃化转变温度（Tg）或热塑性塑料中接近生理温度的熔融温度（Tm）。这种行为可见于聚N‐异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm），它是一种常用于药物递送应用以及组织再生的候选材料[180]。由PNIPAAm和一种不溶于水的聚合物聚己内酯（PCL）打印出的双层结构在受到轻微升高的温度刺激时表现出自折叠或自展开特性；因此，该结构中可观察到酵母细胞封装与释放的现象[24]。在另一项研究中，一种包含聚丙烯酸‐PNIPAAm和基于Al₂O₃的陶瓷粉末的热响应组合可通过施加热刺激实现溶胶‐凝胶转变[181]。

在另一项研究中，Hendrikson等人[182]采用熔融沉积法制备了一种聚氨酯形状记忆结构（Tg ～32°C），以构建活性支架。使用定制的拉伸装置在65°C下打印支架，然后冷却至4°C，并释放以保持过渡形状。随后，将注入的细胞在30°C下培养，以促进细胞黏附和增殖。最后一步中，温度升高至37°C，从而获得稳定的形状。在整个尺寸恢复过程中，所获得的细胞转变为伸长且有序排列的构型。

通常，该过程涉及将热敏性聚合物与靶向细胞、营养物质或生长因子结合，随后将整个组合注入体内。在注射过程中，由于温度升高，聚合物发生相变并转化为凝胶状物质，释放出组分以形成三维结构[183]。

7.2 水或溶剂的影响

另一种常用于驱动生物打印形状记忆聚合物支架中形状记忆效应的刺激因素是水（或溶剂）。水溶性或亲水性聚合物通常在接触湿度时表现出形状记忆效应。最终形状在干燥后获得。当水分子扩散到亲水性SMPs中时，其玻璃化转变温度可能降至室温以下。接近室温的较低玻璃化转变温度（Tg）使得3D打印物体能够在该温度范围内表现出形状记忆效应。与热致形状记忆效应相比，水致形状记忆效应表现出较慢的活性3D打印物体的形状恢复。尽管存在反应时间较慢等缺点，但SMPs对湿度响应的水触发驱动已被有效应用于各种3D打印结构，尤其是在水环境或室温条件下。

例如，Raviv等人[185]展示了三种经典的变形形式——线性拉伸、折叠和环形拉伸——在这些过程中，水会与材料的多个部分相互作用，形成各种构型。在线性拉伸操作中，较硬物质充当支架，而活泼的（亲水性）沉积物产生行程力。该方案通过收集一系列坚硬圆盘并在中心材料拉伸时实现。Tibbits及其他研究团队[186,187]利用Connex Objet500打印机，采用4D打印技术制造出一系列基本单元（或铰链），其具有坚固的塑料基底和亲水性橡胶（水凝胶），在接触水时发生膨胀。除了传统的分层结构的制造，以及基于纳米油墨实现多功能、形态多样且受天然材料启发的结构（例如在接触水时发生转变的叶子和花朵）的仿生4D打印[188]。在墨水从喷嘴出口挤出过程中，纤维素组分的一部分如同在木质纤维挤出中所经历的那样，在剪切应力作用下于水凝胶中自组织排列[189]。这最终导致挤出结构在纵向方向上的特定维度发生溶胀。

朱等人[190]展示了基于纤维素纳米晶须（CNWs）和热塑性聚氨酯的水敏性智能活性聚合物的热致形状记忆效应。在此，当接触水时，CNW渗流网络的可逆形成与断裂有助于实现形状记忆效应。