从培养类器官到用类器官做筛选：Gri3D在肝脏、BBB和肠模型中的应用

摘要： 类器官和3D微组织正在从基础培养逐渐进入药物发现、毒理评价和个体化医疗，但当模型用于大规模实验时，微组织尺寸、孔间重复性、换液丢失、自动成像和数据分析会成为新的限制。Gri3D采用PEG水凝胶微腔阵列，在标准96孔板内形成多个相对均一的类器官或球状微组织，并将其限制在规则空间位置和相近焦平面。本文结合肝细胞球体CYP3A4检测、多细胞BBB类器官抗体穿透以及患者来源直肠类器官Forskolin-induced swelling三个案例，系统介绍Gri3D如何将“可以培养的3D模型”进一步转变为“可以量化和规模化运行的3D Assay”。

关键词：Gri3D、类器官、3D培养、高通量筛选、微组织、肝脏球体、血脑屏障、肠类器官、药物筛选、自动化成像

近年来，类器官技术逐渐从基础发育研究进入药物筛选、毒理评价和患者来源模型研究，但真正开始扩大实验规模之后，很多研究团队会发现，“能够稳定培养类器官”与“能够把类器官用于标准化筛选”之间仍然存在明显距离。药物筛选要求多个重复、不同药物浓度和不同时间点，而类器官本身的大小、位置和操作稳定性又会直接影响最终数据，因此3D培养平台也需要从单纯支持模型形成进一步转向支持自动化和定量分析。

Gri3D是一种基于PEG水凝胶微腔阵列的3D培养板，通过在标准孔板中建立多个规则微腔，使细胞在独立微空间中聚集形成类器官或spheroid。相关Gri3D类器官高通量培养技术资料所关注的重点，也并不仅是如何让细胞形成3D结构，而是如何让形成后的微组织更加适合成像、功能分析和药物筛选。

一、为什么类器官进入药物筛选需要新的3D培养方式

传统ULA低吸附孔板通常采用一孔一个spheroid的模式，在小规模实验中具有操作简单、模型直观的优势。但实验规模扩大后，每一个独立重复都需要占用一个孔，模型数量和筛选通量受到孔位限制，同时球体的位置、尺寸以及自动化成像也会逐渐成为新的变量。

Gri3D利用水凝胶微腔阵列，在同一个孔内提供多个相互独立的3D培养空间。细胞进入微腔后自行聚集，并形成多个微组织，从而让一个标准96孔板孔内同时存在多个独立模型。

二、一个孔不再只有一个球体

原稿中的肝细胞应用对比显示，在使用相同7500个细胞时，ULA 96孔板形成1个spheroid，而对应Gri3D体系则可以形成约55个microtissues。多个微组织不仅增加了同一孔中的生物学重复数量，也改变了整体组织表面积以及培养液与细胞之间的接触条件。

这一模式意味着3D培养的实验单位可以从“孔”进一步细化为“孔中的多个微组织”，对于需要高重复数的毒理和剂量反应研究尤其具有意义。

三、微组织位置和焦平面为什么会影响高通量成像

高通量实验的核心并不是模型数量越多越好，而是模型需要能够被快速、稳定地检测。如果球体在每个孔中的位置和高度随机变化，自动显微镜就需要进行大范围扫描和逐个重新对焦，最终成像时间和图像分析难度都会增加。

Gri3D微腔能够将微组织固定在规则阵列中，并使其位于相对接近的焦平面，因此更加适合批量亮场或荧光成像。以600 μm微孔版本为例，BBB应用中一个孔可以形成约55个类器官，多个微组织能够按照预设空间排列进行同步观察。

四、肝脏球体如何从3D培养进一步进入药物功能评价

肝脏3D模型进入药物开发之后，不仅需要观察细胞存活，还需要检测药物代谢相关功能。CYP450酶活性因此成为肝脏球体的重要功能读出之一。

原稿中的Gri3D肝细胞应用在形成3D spheroid之后继续进行药物处理、细胞活性和CYP酶活性分析。对应实验显示，Gri3D体系中的肝细胞球体具有较高CYP3A4基础活性，加入Ketoconazole之后可以检测到明显的CYP3A4活性下降，而对应ULA实验中的变化并不明显。

这一案例说明，3D高通量平台最终仍然需要通过功能实验验证其作为药物评价模型的适用性，而不能只比较球体形态。

五、BBB类器官如何用于复杂多细胞模型和抗体穿透研究

更加接近生理状态的BBB模型需要多种细胞共同参与，原稿中的应用同时加入brain endothelial cells、pericytes和astrocytes，三类细胞在Gri3D微腔中共同聚集并形成多细胞BBB organoid。

形成后的模型可利用P-gp、NG2和GFAP等标志物观察不同细胞类型和空间结构，并进一步加入候选抗体进行穿透研究。原始应用中比较了未处理对照、非靶向human IgG和Human Brain Shuttle等构建体，通过共聚焦成像观察其在BBB organoid中的分布，并进行荧光定量。

对于CNS药物研发而言，这使BBB模型从结构模拟进一步进入实际候选分子评价。

六、患者来源肠类器官如何用于药物响应评价

Gri3D也可以用于患者来源类器官。原稿中的囊性纤维化研究使用患者来源直肠类器官，并通过Forskolin-induced swelling，也就是FIS实验评价不同CFTR调节剂处理后的功能恢复。

患者来源模型天然存在个体差异，因此培养平台的技术重复性尤其重要。只有尽量减少类器官初始尺寸和位置等技术变量，才能更加可靠地比较患者之间真正的药物响应差异。

七、Gri3D解决的重点为什么在“培养之后”

Gri3D并不是简单提供一种新的球体形成方法，而是试图解决类器官进入功能性实验之后的一系列问题，包括单孔样本数不足、微组织尺寸和位置不一致、换液时容易丢失、自动成像困难以及难以融入标准化高通量流程。

类器官研究的发展路径正在从“是否能够形成类器官”，逐步进入“是否具有正确组织结构与功能”，再进一步进入“是否能够稳定开展规模化药物筛选”。后一阶段要求模型同时具备生理相关性、重复性、通量、成像能力以及自动化兼容性。

八、哪些研究问题更容易从这种多微组织模式中获益

需要大量平行重复的肝毒性和药物代谢实验，通常希望在一个标准板中比较多个药物和剂量，因此多个均一肝球体可以增加单位孔的信息量；BBB和其他复杂CNS模型则可以利用规则微组织进行批量抗体或递送分子穿透评价；患者来源类器官则可以通过更多独立模型降低单个类器官随机差异对最终患者药物响应结论的影响。

其他需要高通量3D功能读出的研究，例如肺、肠道、肿瘤或其他组织类器官，也可以沿着相同逻辑评估微腔阵列是否适合自身模型。真正需要验证的是微腔规格、接种密度和3D结构是否能够维持对应组织所需的生理功能。

九、总结

类器官从基础研究走向药物筛选，并不是简单增加培养数量，而是需要将3D模型转变成一个具有可重复输入、稳定培养、标准化成像和可量化输出的Assay。

Gri3D通过PEG水凝胶微腔阵列，把多个3D微组织集成到标准96孔板中，从空间结构上改善微组织数量、位置和自动成像条件。肝脏球体中的CYP3A4功能检测、BBB类器官中的抗体穿透以及患者来源肠类器官中的FIS功能分析，分别展示了这一培养方式在代谢、屏障和个体化药物响应三个不同方向中的应用。

因此，Gri3D真正解决的并不是“怎样让细胞变成3D”，而是如何让已经成熟的3D模型进一步成为能够批量运行和量化分析的实验系统。

拓展阅读

InSphero Gri3D类器官与3D细胞高通量培养相关技术参考

关于技术来源

本文基于InSphero公开Gri3D技术资料及肝脏球体、血脑屏障类器官和患者来源肠类器官相关应用信息，曼博生物整理，仅用于科研信息分享和实验方案参考。文中7500个细胞、约55个microtissues、600 μm微腔、约48小时BBB自组装、CYP3A4、Ketoconazole以及Forskolin-induced swelling等信息均来源于对应公开应用体系，实际实验结果会受到细胞来源、接种密度、微腔规格、培养条件、药物处理和成像分析方式影响，应针对具体类器官模型进行验证。
本文围绕Gri3D、类器官、3D培养、高通量药物筛选、肝脏球体、BBB类器官、患者来源类器官、自动化成像和3D功能性Assay等方向整理相关公开技术信息。